Назначение наборов
Набор реактивов Real-time-PCR-KRAS-7M предназначен для анализа 7 мутаций в 12 и 13 кодонах гена KRAS, коррелирующих с резистентностью опухолей к лечению ингибиторами EGFR.
Набор реагентов Real-time-PCR-BRAF-V600E предназначен для выявления точечной мутации GTG→GAG в 600 кодоне гена BRAF, коррелирующей с чувствительностью опухолей к лечению ингибиторами BRAF. Также набор детектирует замену GTG на GAA, GAT и AAG. Анализ проводится методом аллель-специфичной ПЦР в реальном времени.
Наборы реактивов предназначенные для выявления точечной мутации CTG→CGG в 858 кодоне гена EGFR и микроделеций 9-18 пар нуклеотидов гена EGFR в районе соответствующем 746-750 аминокислотам белка (Real-time-PCR-EGFR-2M), для выявления активирующих мутаций в 18-21 экзонах гена EGFR (Del19, L858R, L861Q, G719A/C/S, S768I, T790M) (Real-time-PCR-EGFR-7R) коррелирующих с чувствительностью опухолей к лечению ингибиторами ТК-EGFR.
Набор Real-time-PCR-KRAS-7M предназначен для клинической диагностики.
Регистрационное удостоверение ФСР 2012/13492.
Характеристики наборов
Наборы оптимизированы для использования с амплификатором для ПЦР в режиме реального времени “CFX96” (Bio-Rad, США). Использование других приборов возможно, но может потребовать изменения параметров ПЦР и повлиять на чувствительность метода.
Материал для исследования
В качестве материала для анализа используется геномная ДНК. Минимальное количество ДНК, необходимое для анализа, – 2 нг. Максимальное количество ДНК, которое может быть использовано для 1 анализа, – 1000 нг.
Состав наборов
Набор содержит реактивы достаточные для проведения 12/ 36/ 50 реакций с образцами ДНК и контролями. Положительный контроль представляет собой ДНК-копии исследуемого гена с мутацией на фоне ДНК человека без мутаций и позволяет выявить наличие ингибиторов ПЦР, которые могут приводить к ложноотрицательным результатам. Набор также включает контроль без матрицы (вода).
Наборы состоят из пробирок с реагентами с цветными крышками и инструкции по применению.
Условия хранения
Хранить в темноте при -18оС в течение 12 месяцев.
Принцип действия наборов реактивов
Анализ проводится методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени. Продукты ПЦР исследуемого гена (KRAS/ BRAF/ EGFR) идентифицируются в 5′-экзонуклеазной реакции с помощью зонда меченного FAM. Набор содержит реагенты для анализа мутации исследуемого гена (KRAS/ BRAF/ EGFR) и реагенты для внутреннего контроля с использованием красителя ROX. Внутренний контроль позволяет выявить наличие ингибиторов ПЦР, которые могут приводить к ложноотрицательным результатам. ПЦР смеси состоят из всех необходимых реагентов за исключением Taq ДНК полимеразы, поставляемой в отдельной пробирке. Набор также включает ДНК положительного стандарта с мутацией в исследуемом гене (KRAS/ BRAF/ EGFR) и ДНК отрицательного стандарта (ДНК человека без мутации).
Тест на наличие мутаций в исследуемом гене (KRAS/ BRAF/ EGFR) состоит из двух этапов:
Проверка образцов ДНК в контрольной ПЦР
Контрольная реакция проводится для оценки пригодности образцов ДНК для дальнейшего анализа, позволяя выбрать оптимальную концентрацию ДНК исследуемого гена для теста. Причинами непригодности образцов могут быть частичная деградация или химические модификации ДНК, возникшие при фиксации ткани, которые могут ингибировать или снижать эффективность ПЦР. Различные разведения образцов ДНК сравниваются в контрольной ПЦР с ДНК отрицательного стандарта входящей в набор. Качество и количество ДНК оценивается по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флуоресценции пересекает заданный уровень фона. Для этого набор содержит дополнительное количество ПЦР смеси №1, амплифицирующей константный район исследуемого гена. Для дальнейшей аллельспецифичной ПЦР выбирают разведение образца ДНК, которое имеет наиболее близкую величину Ct относительно отрицательного ДНК стандарта.
Проведение аллель-специфичной ПЦР на мутации в исследуемом гене (KRAS/BRAF/EGFR)
На этом этапе выбранные разведения ДНК тестируют в аллель-специфичной ПЦР. Для этого набор включает смесь для ПЦР, содержащую праймеры, специфичные к выявленным мутации в исследуемом гене. Для нормировки результатов все образцы необходимо повторно тестировать в реакции с контрольной смесью. Также в каждый эксперимент необходимо включать ПЦР с положительным стандартом и контролем без матрицы. Для корректности результата все образцы тестируют в дублях.
Для всех образцов ДНК результаты ПЦР для каждой мутации в исследуемом гене (KRAS/ BRAF/ EGFR) представляют в виде разницы dCt = CtAS – CtC, где CtAS – среднее Ct образца ДНК в ПЦР специфичной к данной мутации в исследуемом гене (KRAS/ BRAF/ EGFR), CtC — cреднее Ct того же образца ДНК в контрольной ПЦР. Затем dCt образца сравнивают с dCt положительного стандарта содержащего ДНК
с каждой мутацией для исследуемого гена (KRAS/ BRAF/ EGFR).
Образец является положительным (содержащим мутацию), если dCt образца равно или меньше dCt положительного стандарта.
1 — CtC для Положительного стандарта и неизвестных образцов ДНК,
2 — CtAS для неизвестного образца ДНК #1,
3 — CtAS для Положительного стандарта,
4 — CtAS для неизвестного образца ДНК #2.
Образец ДНК #1 положительный (dCt#1<dCtm).
Образец ДНК #2 отрицательный (dCt#2>dCtm).
Образцы ДНК без мутаций могут также давать значение CtAS больше 35.
Пример кривых флуоресценции в контрольной (пунктирные линии) и аллель-специфичной (сплошные линии) ПЦР для Положительного стандарта (красный) и неизвестных образцов ДНК (синий и зеленый).
Образец является отрицательным (без мутации или содержание мутации: менее 5% для гена KRAS, или менее 1% для генов BRAF и EGFR), если dCt образца больше dCt положительного стандарта.
Анализ на выявлении мутации в образцах ДНК исследуемого гена (KRAS/ BRAF/ EGFR).
Каталог нашей продукции
