Ранняя диагностика колоректального рака (КРР) с помощью анализа крови на SEPT9 от лаборатории генодиагностики «БиоЛинк»
Общие вопросы
Что такое анализ крови на SEPT9?
Анализ крови на SEPT9 это молекулярный тест, который обнаруживает метилированную ДНК Септина 9 (SEPT9) в крови. Септин 9 — это белок, участвующий в делении клеток. Метилирование ДНК гена SEPT9 отключает ген. Отключение гена SEPT9 связано со злокачественной трансформацией и развитием колоректального рака. ДНК Септина 9 (SEPT9) подвергается метилированию в опухолевых клетках колоректального рака чаще, чем в нормальных клетках. Метилированная ДНК SEPT9 попадаетв кровоток из опухолей, локализованных в кишечнике, и может служить дифференциальным биомаркером колоректального рака.
Почему анализ крови?
Анализ крови является распространенным и общепринятым методом тестирования. Этот тест подходит для людей, которые не могут или не хотят проходить общепринятые скрининговые тесты на КРР, такие как колоноскопия или анализ кала на скрытую кровь. Анализ крови потенциально может повысить участие в скрининге соответствующей группы населения, которая не проходит скрининг.
Какой биомаркер используется в анализе на SEPT9?
Анализ крови на SEPT9 представляет собой тест, основанный на обнаружении метилирования ДНК в определенной последовательности гена SEPT9. Исследуемый материал – свободноциркулирующая ДНК в плазме крови.
Что такое свободноциркулирующая ДНК?
Свободноциркулирующая ДНК (сцДНК) появляется в плазме крови в результате некроза или апоптоза клеток опухоли.
Что такое метилирование ДНК?
Метилирование ДНК является естественным биологическим процессом. Эта модификация связана с регуляцией работы генов. Изменения в метилировании ДНК часто возникают при раке и могут служить биомаркером для обнаружения рака.
Сбор крови и подготовка образцов
Какие пробирки необходимо использовать для сбора образцов крови?
Необходимо использовать вакутейнеры с ЭДТА с сиреневыми крышками
Сколько крови необходимо взять у пациента?
Для проведения теста необходимо минимум 30 мл крови (3 пробирки).
Важно! Цельную кровь не замораживать!
Как следует транспортировать пробирки с кровью?
Транспортировка образцов крови из заборного пункта в лабораторию должна осуществляться при температуре от 2° до 8°C не более 4 часов.
Можно ли использовать сыворотку вместо плазмы?
Анализ на ДНК SEPT9 был разработан с использованием плазмы, полученной из пробирок для сбора крови с ЭДТА. Сыворотку вместо плазмы использовать в этом анализе нельзя.
Существуют ли особые требования к подготовке плазмы?
Цельная кровь, собранная в пробирки для сбора крови, может храниться при температуре от 2° до 8°C до приготовления плазмы не более 4 часов.
Лейкоциты являются источником сцДНК в плазме крови, поэтому важно отделить лейкоцитарную фракцию перед выделением ДНК.
Важно! Соблюдать режим центрифугирования и рекомендации по приготовлению плазмы крови для анализа на SEPT9, описанные в приложении к инструкции.
Набор реагентов «Real-time-PCR-SEPT9»
Для чего предназначен набор реагентов «Real-time-PCR-SEPT9»?
Набор реагентов предназначен для выделения сцДНК плазмы крови, бисульфитной конверсии ДНК и выявления ДНК-метилирования в области гена SEPT9 методом ПЦР в реальном времени.
Каков принцип действия набора реагентов «Real-time-PCR-SEPT9»?
Метилирование ДНК в области промотора гена SEPT9 является маркером колоректального рака. Когда сцДНК, выделенную из образцов плазмы, обрабатывают бисульфитом в высокой концентрации (бисульфитная конверсия), неметилированные цитозины превращаются в урацил, тогда как метилированные цитозины остаются неизменными. В результате бисульфитной конверсии последовательность ДНК изменяется в зависимости от статуса метилирования и может быть проанализирована с помощью ПЦР в реальном времени.
Как определяется степень метилирования гена SEPT9?
Технология предполагает использование праймеров, которые амплифицируют целевую ДНК независимо от статуса метилирования. Блокирующий олигонуклеотид подавляет амплификацию неметилированной ДНК, а зонд, специфичный для метилирования, позволяет обнаруживать метилированную последовательность. Такая технология дает возможность детектировать очень малые количества ДНК опухоли на фоне неопухолевой ДНК в плазме.
После проведения бисульфитной конверсии, в случае неметилированной ДНК блокирующий олигонуклеотид предотвращает амплификацию мишени, а зонд, специфичный для метилирования, не связывается с мишенью и сигнал не регистрируется.
В случае метилированной ДНК блокатор не связывается с мишенью, амплификация продолжается, зонд связывается с метилированной последовательностью-мишенью и производит флуоресценцию при гидролизе во время амплификации.
Какие компоненты входят в состав набора реагентов «Real-time-PCR-SEPT9»?
Набор содержит реагенты для выделения ДНК, бисульфитной конверсии, а также реагенты для проведения ПЦР в реальном времени.
Контрольные образцы (внутренний контрольный образец, положительный контрольный образец и отрицательный контрольный образец) входят в состав набора.
Какова схема рабочего процесса?
Схема проведения исследования представлена на рисунке:
Параллельно с клиническими образцами, обязательно проводится бисульфитная конверсия контрольных образцов (ПКО и ОКО). Полученные образцы ДНК клинических и контрольных образцов после бисульфитной конверсии используются для проведения ПЦР в реальном времени. Каждый из клинических образцов и контролей ставится в трех повторах. В каждой постановке кроме клинических образцов должны анализироваться ПКО и ОКО.
Набор рассчитан на проведение анализа 46 клинических образцов и 2 контрольных образцов. Что делать, если в лаборатории меньше клинических образцов?
Количество реагентов, содержащихся в наборе, достаточно для проведения анализа 48 проб – 46 клинических образцов и 2 контрольных образцов (ПКО и ОКО).
Однако, компоненты набора поставляются в аликвотах, позволяющих проводить несколько постановок, содержащих меньшее количество клинических образцов. Количество реагентов достаточно для подготовки 12 контрольных образцов, таким образом, возможно проведение шести независимых постановок по 8 образцов (6 клинических и 2 контрольных).
Можно ли заменять компоненты набора?
Нет. Протокол одобрен для использования только с компонентами набора, которые указаны в инструкции по применению.
Можно ли использовать систему для выделения ДНК сторонних производителей?
Нет. Необходимо использовать только систему для выделения ДНК, входящую в состав набора.
Можно ли использовать другой амплификатор?
Набор одобрен для использования только с термоциклером для амплификации нуклеиновых кислот 1000, с принадлежностями исполнения: «C1000 Touch» в комплекте с «Модуль реакционный оптический CFX96 (Optical Reaction Module CFX96)», производства «Bio-Rad Laboratories, Inc.», США.
Есть ли специфика работы с магнитными частицами?
Да. Магнитные частицы нельзя замораживать.
Также необходимо следить, чтобы осадок магнитных частиц не терялся при проведении процедуры выделения ДНК.
Как интерпретировать полученные результаты?
Анализ результатов состоит из двух этапов.
На первом этапе оценивают пригодность образца для теста. Для этого оценивают амплификацию внутреннего контрольного образца (гена β-актина) согласно параметрам, указанным в инструкции. Если амплификация внутреннего контрольного образца в клиническом образце удовлетворяет требованиям инструкции, такой образец считается пригодным для анализа, а результат достоверным.
В случае, если амплификация внутреннего контрольного образца в клиническом образце не удовлетворяет требованиям инструкции, такой образец считается непригодным для анализа, а результат недостоверным. Следует сделать повторный забор крови у пациента, и повторить всю процедуру, начиная с выделения сцДНК.
На втором этапе оценивают степень метилирования участка гена SEPT9. Если минимум в одном повторе из трех сигнал амплификации оказывается положительным (согласно требованиям инструкции), следует считать метилирование участка гена SEPT9 выявленным.
Каковы преимущества работы с набором реагентов «Real-time-PCR-SEPT9»? Все компоненты в одном наборе: для выделения сцДНК из плазмы крови, бисульфитной конверсии и проведения ПЦР в реальном времени.
— Все компоненты в одном наборе: для выделения сцДНК из плазмы крови, бисульфитной конверсии и проведения ПЦР в реальном времени.
— Внутренний контрольный образец контролирует качество пробоподготовки клинических образцов и адекватную концентрацию ДНК.
— Положительные и отрицательные контрольные образцы в составе набора отслеживают успешный рабочий процесс и обеспечивают достоверность результатов.
— Знакомая технология ПЦР в реальном времени.
— Гибкий рабочий процесс адаптируется к требованиям рабочей нагрузки персонала.