Наборы реактивов для избирательного обогащения ампликонов ДНК

Для анализа мутаций в генах KRAS при колоректальном раке и EGFR при раке легкого широко используется метод секвенирования по Сэнгеру.
Метод Сэнгера является универсальным, но имеет существенное ограничение — низкая чувствительность. Для достоверного определения последовательности нуклеотидов методом Сэнгера, количество мутантной ДНК в образце должно составлять по меньшей мере 20-25%, что соответствует 40-50% опухолевых клеток при гетерозиготной мутации. В большинстве случаев участок опухолевой ткани невозможно отделить от нормальной ткани и участков воспалительной инфильтрации, что в процессе секвенирования может привести к содержанию ДНК с мутацией в образце менее 25%, и как следствие к ложно-отрицательным результатам. С целью повышения чувствительности традиционного секвенирования по Сэнгеру нами был разработан метод обогащения мутантными последовательностями KRAS и EGFR с помощью метода ПЦР с LNA-модифицированными олигонуклеотидами. Чувствительность наборов SelectSeq-KRAS, SelectSeq-EGFR составляет 5% и более мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа».

 график 8

иконка 19

иконка 16Назначение набора 

Наборы предназначены для избирательной амплификации фрагментов ДНК с любыми мутациями 12 или 13 кодонов гена KRAS и делециями 19 экзона и мутации L858R в 21 экзоне гена EGFR для последующего анализа методом секвенирования по Сэнгеру. Наборы предназначен только для исследовательского применения.

Иконка 12Характеристики набора

Для ПЦР используется ДНК, выделенная из свежезамороженной ткани или ткани фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPET) без дополнительной диссекции что существенно упрощает процесс подготовки образцов.

 таблица 12

иконка 16Принцип действия набора

Наборы содержат смеси для ПЦР, прямой и обратный праймеры, используемые в дальнейшем для секвенирующей ПЦР. Процесс получения ПЦР продукта состоит из двух этапов:

12 Селективное обогащение ДНК с мутацией

На этом этапе нарабатываются преимущественно ампликоны с мутацией, а амплификация ДНК «дикого типа» подавляется с помощью LNA-модифицированных олигонуклеотидов, блокирующих амплификацию фрагментов без мутации. Продукт, полученный на данном этапе, имеет низкую концентрацию и может не наблюдаться на электрофорезе.

11Амплификация обогащенного продукта

На данном этапе проводится амплификация ДНК для достижения концентрации, достаточной для последующего секвенирования. Полученный продукт в дальнейшем очищается от оставшихся компонентов ПЦР и праймер-димеров любым общепринятым методом (элюция из ПААГ геля, колонки и пр.). Очищенный продукт используют в секвенирующей ПЦР с праймерами входящими в состав набора согласно протоколу производителя реактивов и/или прибора для секвенирования. При секвенировании продуктов, полученных с помощью наборов SelectSeq-KRAS и SelectSeq-EGFR выявляются мутации, присутствующие в 5% и более мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа». При этом при секвенировании ПЦР продуктов полученных обычным способом, достоверно определяются мутации только в образцах содержащих более 20% мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа».

иконки 13Материал для исследования

В качестве материала для анализа используется геномная ДНК. Минимальное количество ДНК, необходимое для анализа, – 3-6 нг.

иконки 14Состав набора

Набор содержит реактивы достаточные для проведения 50 реакций.

иконки 15Условия хранения

Хранить в темноте при -18оС в течение 12 месяцев.

 таблица 13

 Скачать каталог нашей продукции

PDF-Icon

Читать также:

Наборы реактивов для детекции мутаций, связанных с наследственными формами рака Подробнее…

Наборы реактивов для детекции соматических мутаций Подробнее…

Наборы реактивов для выделения ДНК Подробнее…

 

Связаться с нами с помощью контактной формы:

Ваше имя (обязательно)

Ваш e-mail (обязательно)

Тема

Сообщение

Комментарии запрещены.