Для анализа мутаций в генах KRAS при колоректальном раке и EGFR при раке легкого широко используется метод секвенирования по Сэнгеру.
Метод Сэнгера является универсальным, но имеет существенное ограничение — низкая чувствительность. Для достоверного определения последовательности нуклеотидов методом Сэнгера, количество мутантной ДНК в образце должно составлять по меньшей мере 20-25%, что соответствует 40-50% опухолевых клеток при гетерозиготной мутации. В большинстве случаев участок опухолевой ткани невозможно отделить от нормальной ткани и участков воспалительной инфильтрации, что в процессе секвенирования может привести к содержанию ДНК с мутацией в образце менее 25%, и как следствие к ложно-отрицательным результатам. С целью повышения чувствительности традиционного секвенирования по Сэнгеру нами был разработан метод обогащения мутантными последовательностями KRAS и EGFR с помощью метода ПЦР с LNA-модифицированными олигонуклеотидами. Чувствительность наборов SelectSeq-KRAS, SelectSeq-EGFR составляет 5% и более мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа».
Наборы предназначены для избирательной амплификации фрагментов ДНК с любыми мутациями 12 или 13 кодонов гена KRAS и делециями 19 экзона и мутации L858R в 21 экзоне гена EGFR для последующего анализа методом секвенирования по Сэнгеру. Наборы предназначен только для исследовательского применения.
Для ПЦР используется ДНК, выделенная из свежезамороженной ткани или ткани фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPET) без дополнительной диссекции что существенно упрощает процесс подготовки образцов.
Наборы содержат смеси для ПЦР, прямой и обратный праймеры, используемые в дальнейшем для секвенирующей ПЦР. Процесс получения ПЦР продукта состоит из двух этапов:
Селективное обогащение ДНК с мутацией
На этом этапе нарабатываются преимущественно ампликоны с мутацией, а амплификация ДНК «дикого типа» подавляется с помощью LNA-модифицированных олигонуклеотидов, блокирующих амплификацию фрагментов без мутации. Продукт, полученный на данном этапе, имеет низкую концентрацию и может не наблюдаться на электрофорезе.
Амплификация обогащенного продукта
На данном этапе проводится амплификация ДНК для достижения концентрации, достаточной для последующего секвенирования. Полученный продукт в дальнейшем очищается от оставшихся компонентов ПЦР и праймер-димеров любым общепринятым методом (элюция из ПААГ геля, колонки и пр.). Очищенный продукт используют в секвенирующей ПЦР с праймерами входящими в состав набора согласно протоколу производителя реактивов и/или прибора для секвенирования. При секвенировании продуктов, полученных с помощью наборов SelectSeq-KRAS и SelectSeq-EGFR выявляются мутации, присутствующие в 5% и более мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа». При этом при секвенировании ПЦР продуктов полученных обычным способом, достоверно определяются мутации только в образцах содержащих более 20% мутантных копий генов KRAS и EGFR на фоне ДНК «дикого типа».
В качестве материала для анализа используется геномная ДНК. Минимальное количество ДНК, необходимое для анализа, – 3-6 нг.
Набор содержит реактивы достаточные для проведения 50 реакций.
Хранить в темноте при -18оС в течение 12 месяцев.